腺病毒病原学

发布时间:2019-10-29       作者:DDM       来源:临床实验室        浏览:2138       收藏: 1

一、绪 论

1953年,Rowe和他的同事们用患者的扁桃体组织,拟分离“流感病毒”,但意外发现培养出的单层细胞中有一些出现了细胞病变(cytopathic effect,CPE),后来证明细胞病变是由潜伏在腺样组织内的新病毒所致。1962年该病毒被正式命名为腺病毒,并分为两个属,分别为哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus)。目前腺病毒共有100多个血清型,其中对人类致病的有57个血清型,分别命名为Ad1~Ad57。根据其生物学性状可将人腺病毒(human adenovirus,HAdV)分为A~G等7组(或亚属)。


腺病毒通常在呼吸道、眼部、胃肠道和尿道等部位增殖并引起疾病,也可在淋巴样和腺样组织中潜伏感染,并持续数月。主要临床表现为急性发热性呼吸道感染、咽结合膜热、流行性角结膜炎、胃肠炎和腹泻等疾病,有的血清型还可以引起动物肿瘤。严重感染常见于免疫抑制/免疫功能低下人群,如器官移植患者、艾滋病患者和先天性或联合免疫缺陷者等。腺病毒作为机会性病原长期存在于人群中,尤其在居住密集场所如军营、学校、养老院等场所,易出现急性发热性呼吸道感染等的暴发流行。


二、腺病毒的结构及化学组成

1. 腺病毒结构

腺病毒为二十面体立体对称、无包膜的球形双链DNA病毒。腺病毒粒子为T=25的二十面体,直径70~100nm,在感染的细胞核内常呈晶格状排列。病毒衣壳呈二十面体对称,有252个直径8~10nm的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,每边6个,其中240个为六邻体(hexon,非顶点壳粒),另12个为五邻体(penton,顶点壳粒)。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体,三聚体的六邻体分子有一个三角形的塔尖和五面体的基底,塔区由4个环构成,即loop1、loop2、loop3和loop4;基底包含两个区域,即P1区和P2区。六邻体上的表位(epitope)是诊断不同血清型的标准,它包含哺乳动物腺病毒属的抗原成分,是病毒体对免疫选择压力最敏感的部位。每个五邻体基底上结合着1根(哺乳动物腺病毒)或2根(禽腺病毒)长9~77.5nm的纤维突起(antennal fiber,纤突),这些纤维以五邻体蛋白为基底由衣壳面伸出,纤维顶端形成头节区(顶球),纤维有血清特异性,且含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。


每个腺病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR),是复制的起始位点。在左端ITR的3’端有一段长约300bp的包装信号(Ψ)介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言,只有包括两端的ITR和包装信号(Ψ)的约0.5kb的序列是顺式作用元件,也就是说必须由腺病毒载体自身携带,而其他的30余种蛋白质都可以通过辅助病毒(或细胞)反式补足。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1~E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1~L5基因。线状双股DNA与核心蛋白形成直径为60~65nm的髓芯,被包裹于衣壳内。


2. 腺病毒的化学组成

腺病毒的病毒蛋白约11种(TP和PI-PX),其中有4种蛋白质(病毒多肽PV、PVII、末端蛋白TP、酶蛋白PX)与病毒基因(双股线性DNA)构成病毒核心,多肽PII是主要的核心蛋白,包裹着病毒基因DNA。构成病毒衣壳的有7种蛋白质,其中多肽PII是病毒衣壳中最丰富的和最重要成分,六邻体由3个PII分子紧密相连组成。多肽PVI、PVIII在六邻体与病毒核心之间形成连接桥,并与多肽PIX一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽PIII相连构成五邻体的基座蛋白,PIIIa为五邻体的周围蛋白,也参与衣壳的组成,五邻体通过PV与病毒核心相连。多肽PIV主要构成病毒三聚体纤突,纤突与病毒血凝活性相关,因血凝素(纤突)具有型特异性,常用血凝抑制实验(HI)对临床分离株进行分型。纤突和五邻体基座在病毒衣壳和宿主细胞表面相互作用方面起重要作用。此外,病毒颗粒含有大约10个拷贝的腺病毒半胱氨酸蛋白酶,可在病毒成熟期切割结构性蛋白。


腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在,由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地围绕在其周围,起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来,并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5’端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白(precursor terminal protein,pTP)复合物(DNA-TPC,DNA-precursor terminal protein complex)的特化的结构,与腺病毒复制密切相关。


腺病毒DNA和蛋白质的含量分别为13%和87%,病毒体相当于分子质量约为175X106。Ad12、Ad18和Ad31型的DNA组成中,(G+C)mol%最低(48%~49%),属于对动物具有高致癌性的血清型;Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad8等型的(G+C)mol%较高(61%),致癌性反而较低或无。这也是人腺病毒分离株的分组标准,据此可将腺病毒分为A~G共7组。


3. 病毒基因结构与功能

腺病毒复制过程中基因组转录产生mRNA,已知的病毒基因产物至少有5种,各自执行着不同的生物学功能。


E1区基因表达产物:可以进一步分为E1A和E1B。E1A主要由两种成分构成,分别为289R(或13S)和243R(或12S)。这些E1A蛋白的主要功能是调节细胞代谢,使细胞对病毒复制更易感。E1B 19K与细胞Bcl-2基因的表达产物同源,可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。E1B 55K基因产物可以下调p53基因的转录水平,当然这种调节功能不是绝对的,其他一些腺病毒基因(如E4 ORF6)也参与了这一过程。另外,E1B 55K基因产物还与病毒复制、病毒晚期mRNA的转录及病毒RNA转运有关。E1A和E1B基因产物还可以刺激细胞进入S期,使其成为病毒DNA复制的理想环境,因此被认为是致癌基因。


E2区基因表达产物:可分为E2A和E2B。其中,E2A(72K)即DNA结合蛋白(DNA binding protein,DBP);E2B主要产物有两种,分别是末端蛋白前体(precursor terminal protein,pTP)和病毒DNA聚合酶(DNA polymerase,pol)。三种蛋白质与至少三种细胞内的因子相互作用,启动腺病毒DNA复制以及病毒晚期基因的转录和翻译过程。


E3区基因表达产物:主要功能是破坏宿主的免疫防御机制,而与病毒基因组的复制无关。E3基因的产物之一——腺病毒死亡蛋白(adenovirus death protein,ADP)分子质量为11.6kDa,可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒。Gp 19K蛋白可以在内质网上与MHC-I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面,并且可以延缓MHC-I的表达。RIDα&β可以抑制由TNF诱发的细胞凋亡,促进Fas降解,下调TNF受体水平。


E4区基因表达产物:E4区的基因产物通常被称为ORF 1-6/7,主要与病毒mRNA的代谢有关,还有促进病毒DNA复制以及关闭宿主蛋白合成的功能。研究发现,一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合,防止病毒DNA发生串联。由于该激酶可以激活p53基因,因此认为一些E4区基因产物可以抑制细胞凋亡。许多E1B和E4基因产物都与拮抗E1A蛋白功能有关。例如,E4 ORF4抑制E1A对E2F启动子的激活;E4 ORF3VA RNA是一些由腺病毒转录的非翻译RNA,与腺病毒抵抗宿主细胞免疫有关。


L基因表达产物:所有晚期表达(L)基因都是由R链上的单一启动子翻译的,并形成占腺病毒基因组长度约80%的RNA产物,出现的多重拼接可产生至少18个不同的mRNA,这些mRNA根据所使用的5个不同的多聚腺苷酸位点而被分为5组。所有晚期mRNA均翻译成子代病毒颗粒装配所需蛋白质。除了由RNA多聚酶II翻译的这些基因外,还有1或2种被称为腺病毒基因(VA),是由宿主RNA多聚酶III转录的。它们的主要功能是抑制宿主的干扰素系统。


三、病毒的培养与复制

1. 病毒的体外培养

腺病毒在体外只能在人源的组织细胞中增殖,人胚肾细胞易感,在293细胞系、HEP-2、HeLa等细胞中生长良好,可引起细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状等典型细胞病变(CPE),实验室常用上述细胞进行病毒的分离鉴定。


常用A549、Hep-2和HeLa细胞来培养临床标本中的腺病毒。除Ad40和Ad41型外,其他腺病毒血清型在人上皮细胞系上生长良好,会导致细胞圆缩,出现核内包涵体聚集成串等病变现象,2~7d可见细胞病变,并可持续到28d。


2. 病毒的复制

腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒黏附和进入宿主细胞,将基因组释放到宿主细胞核中,以及有选择地转录和翻译早期基因。在这个阶段,细胞为病毒基因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒(即第二阶段)做好了准备。第一阶段将在6~8h内完成,第二阶段则更快,只需4~6h。


第一阶段(病毒黏附和进入细胞):腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区黏附到细胞表面的特异性受体开始的。因为人腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体,因为这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体,即CAR,接下来病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。在溶酶体的酸性环境下,腺病毒衣壳的构象将发生变化,被从溶酶体中释放出来,躲过溶酶体的消化作用。最后,腺病毒颗粒转位到细胞核,通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内。相对于脂质体转染,腺病毒基因组进入细胞核是一个非常高效的过程,一般可达到40%,虽然核孔释放进入胞质的效率与脂质体转染相当,但后者DNA进入细胞核的效率却只有前者的1/1000。


第二阶段(转录与复制):一旦病毒基因组进入细胞核,就将进行一系列复杂而有序的逐级放大的剪切和转录过程。通常,以病毒DNA开始复制为分界线,按转录时间的先后,将腺病毒基因大致区分为早期转录单位(E1~4)和晚期转录单位(L1~5)。各种腺病毒基因又可以进一步地分为更小的转录单位,如E1区可以进一步分为E1A和E1B,每个转录单位都至少有一个独特的启动子。腺病毒基因组进入细胞核后,细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合,表达E1A蛋白,该蛋白质的作用是调节细胞代谢,是病毒DNA更易于在细胞中复制。E1A蛋白还可以激活其他早期基因(E1B、E2A、E2B、E3和E4)的启动子,其中E2B驱动另外三个与病毒复制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体(precursor terminal protein,pTP)、单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding proteins,ssDBP)及DNA聚合酶(DNA polymerase)的表达,这三个基因的表达产物紧密地结合成一个复合物,与至少三种细胞蛋白质相互作用,启动病毒基因组的复制。


一般而言,DNA的复制是由RNA启动的,而在腺病毒却是所谓的蛋白启动(protein-priming)。如前所述,腺病毒双链DNA的每条单链的5’端有pTP蛋白结合,pTP通过其Ser-OH DNA 5’端的dCMP 5’磷酸之间形成磷酸二酯键。腺病毒的DNA复制首先是以5’端结合有pTP的dCMP作为引物,以3’端的末端反向重复序列(ITR)为模板,进行链置换(strand displacement)合成,置换出腺病毒的单链分子可以自我退火环化,形成锅柄样环行分子,然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。


病毒基因组复制通常在感染后数小时开始,同时早期基因的转录和翻译被关闭,晚期基因开始表达。大部分的晚期基因的转录是由一个共同的主要晚期启动子(major late promoter,MLP)调控的。实际上,MLP的活性与病毒基因组复制密切相关,有研究表明一旦腺病毒基因组开始复制,MLP的活性将明显增强。晚期基因主要编码腺病毒的结构蛋白。病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳,病毒的基因组被包装进去,形成有感染能力的病毒颗粒,并最终裂解宿主细胞被释放出去,完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明显的种属特异性,人的野生型5型腺病毒(wtAd5)感染其他的非人类细胞(如鼠类细胞)后可以表达早期基因,基因组也可有一定程度的复制并能够形成一些不成熟的病毒颗粒,却不能形成成熟的病毒颗粒,也不能二次感染其他细胞。


3. 腺病毒复制周期中关键时间点

腺病毒感染HeLa细胞过程中病毒和宿主细胞发生主要变化如下。在感染后约10h宿主的DNA合成开始迅速下降,15h降到最低水平;而从15h开始感染性的病毒量迅速增加,在30h达到高峰(104 PFU/个细胞)。在感染25h后,宿主的蛋白质合成也开始迅速下降,在30h后降到最低。在整个感染过程中出现最早的是E1A、E2A和 E4以及其他早期蛋白,在感染5h后开始晚期转录、病毒DNA复制、病毒颗粒蛋白质合成以及宿主防御系统的干预等。


4. 病毒抵抗力

腺病毒对酸碱度及温度的耐受范围较宽,非常耐热、耐酸,在4℃环境中保存,可存活70d,在-40℃环境中保存,可长期存活;36℃、7d病毒感染力无明显下降,但56℃、30min可将其灭活。从北京市的一次腺病毒疫情中采集的标本,间隔2个月之久,标本拭子已近干涸,但仍分离到病毒,提示腺病毒在外界环境中的抵抗力较强。腺病毒在低pH环境下可稳定存在,有很强的耐物理和化学试剂的能力;对乙醚也有耐性;由于它不含脂肪,对脂溶剂(如胆碱)的抵抗力也很强。将Ad12、18和31型注入幼小的啮齿动物时,有高度的致癌性(接种到新生的地鼠,经数月后可出现肉瘤),而其他型别的腺病毒则很少有致癌作用。


四、腺病毒受体

近年来对腺病毒受体的研究取得了很大的进展,这些研究进一步揭示了腺病毒在感染过程中与受体的相互作用,以及受体在病毒进入细胞和组织嗜性方面的作用。腺病毒的吸附是通过其表面的纤突与细胞表面高亲和性受体结合。不同组的腺病毒细胞受体有所不同。


腺病毒不同血清型的组织趋向性不同,主要与腺病毒的型别有关。人类腺病毒C组、E组和部分B组病毒通常感染呼吸道,其他部分B组感染泌尿道,A组和F组主要感染胃肠道、D组主要感染眼部。决定病毒趋向性的重要因素是病毒最初进入宿主并与细胞的结合。


1. 腺病毒受体的种类

(1)柯萨奇-腺病毒受体

柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackic-adenovirus receptor,CAR)是研究最多的腺病毒受体,除B组和D组外,其他组的腺病毒受体都是CAR。CAR又称为HeLa细胞膜结合蛋白,是柯萨奇病毒与腺病毒的特异性受体,其本质是一种细胞黏附分子,在上皮细胞的紧密连接和细胞间相互连接处表达。其分子大小为46kDa,有两个免疫球蛋白样的细胞外结构域,因此被归类为免疫球蛋白超家族。CAR主要介导细胞的嗜同性黏附,并在细胞内以特定的连接结构存在。CAR是分子质量较大的跨膜糖蛋白,该蛋白质贯通细胞膜,分为胞外区、跨膜区、胞内区。CAR表达水平在介导腺病毒感染方面起着重要作用,其表达在体内是可调节的,具有阶段依赖性,CAR受体表达越高,提示组织器官越容易感染。尽管CAR在人类组织的分布尚未完全清楚,但在多种器官包括心脏、脑、胰脏、小肠、肺、肝和肾脏都有CAR的mRNA。CAR在这些靶细胞上的表达允许某些型的腺病毒黏附,包括A(Ad12)、C(Ad2、Ad5)、E(Ad4)、F(Ad41)。CAR也可作为一些动物腺病毒的受体。


(2)CD46

CD46是一种所有有核细胞均表达的辅助调节蛋白,主要介导与B组腺病毒的结合。进一步的竞争实验提示B组(B1和B2)病毒至少与包括CD46在内的两种受体结合,而CD46是其主要结合受体。有趣的是,CD46还是其他病原体包括麻疹病毒、人类疱疹病毒、链球菌、致病性奈瑟氏菌等的受体。研究显示,分离的纤突顶球部分片段可阻断病毒与CD46的结合,提示病毒与CD46的结合部位是在纤突的顶端。然而,具体的结合部位尚有待进一步明确,有可能同一个CD46分子与不同型别的病毒结合的部位有所不同。


(3)CD80和CD86

CD80和CD86在T细胞激活中起重要作用,主要在抗原提呈细胞上表达。它们主要参与Ad3型和Ad7型腺病毒的结合。复制缺陷性腺病毒正在被用于研制疫苗载体,在树突状细胞上表达的病毒靶受体(包括CD46、CD80、CD86)可以引起较强的免疫应答。


(4)唾液酸受体

唾液酸(sialic acid,SA)是糖蛋白和糖脂上常见的一种多糖成分,它主要介导D组中三种腺病毒(Ad37、8和19a型)的黏附和感染。晶体研究证实SA可与腺病毒纤突的顶球部结合。上述三种病毒都通过与SA结合而导致结膜炎,但目前还不清楚为何这种结合可导致对结膜组织的特殊嗜性。


(5)整合素αMβ2和αLβ2

在一些情况下,腺病毒可通过其五邻体直接与细胞表面的整合素αMβ2和αLβ2相互作用实现黏附,这一过程不需要纤突与其受体相互作用。Ad2型病毒纤突缺乏,能通过吸附到细胞表面整合素αMβ2和αLβ2而感染CAR阴性的单核细胞。整合素在细胞表面的表达水平高低可影响腺病毒的感染率。


(6)去硫酸乙酰肝素链

去硫酸乙酰肝素链(heparan sulfate glycosaminoglycan,HS-GAG)是一种长链多相且高度硫酸化的糖类,广泛在于细胞外基质和细胞表面的多糖-蛋白质复合体中。Ad2型和Ad5型是非CAR依赖的,主要依靠HS-GAG黏附和感染。


(7)其他蛋白质和非蛋白质受体

研究表明,I型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex-I,MHC-I)、I型血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule I,VCAM-I)和二棕榈酰卵磷脂(dispalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)也可能是Ad5型的受体,但还有待进一步研究证实。


2. 腺病毒与受体相互作用的影响因素

有很多因素均可妨碍病毒与靶细胞上的受体结合。免疫系统可能是最重要的屏障,因为免疫缺陷患者感染腺病毒后会呈弥散性感染,而这种现象在免疫正常人群中几乎看不到。其次,血脑屏障的内皮连接结构可能会防止病毒与中枢神经系统内的受体结合。与HS-GAG和SA的相互作用可以将病毒阻滞在细胞外基质或细胞的多糖-蛋白质复合体上。由于CAR位于细胞间的连接上,所以病毒要实现与CAR的黏附,需要首先突破细胞间的连接。

   

由于腺病毒是通过不同的受体来黏附到不同细胞表面上的分子并穿入靶细胞而导致病毒感染,近年来有关受体研究的报道越来越多,但仍有许多未尽事宜。例如,病毒与已知受体结合的具体结构尚不清楚,许多腺病毒血清型并无特异性的受体,因此提示可能还有尚未认知的受体。对于病毒与受体CD46等相互作用后是如何参与致病性尚有待研究。


五、腺病毒的分型

腺病毒的血清分型通常是用特异性抗血清进行血凝抑制或中和试验来确定的,由于腺病毒血清型众多,特异性抗血清来源困难及价格昂贵、操作复杂等原因,使得血清分型在普通实验室难以开展。中和试验结果主要是由病毒的六邻体和纤突蛋白上的抗体结合位点决定的,病毒纤突蛋白的中轴部分负责与红细胞结合。六邻体上的高变区在病毒表面形成一些血清型特异性的环状结构。根据腺病毒凝集红细胞能力的不同,可将病毒分为57个血清型;根据免疫学、生物学、生物化学特性不同,有将其分为A~G共7组,不同血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。


应用基于核酸序列差异的分子分型技术,如对PCR产物进行限制酶酶切分析和序列分析等,可以将腺病毒分为不同的基因型。血清型和基因型并不完全相对应,在同一个血清型内,也可以区分不同的基因型。免疫学检测方法可进行快速诊断,但一般不能进行腺病毒分型。对腺病毒分型,主要应用于流行病学调查。


本栏目部分文章摘自科学出版社

《疾病与生命科学前沿研究丛书——腺病毒感染》


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