腺病毒实验检测

发布时间:2019-10-29       作者:DDM       来源:临床实验室        浏览:2102       收藏: 0

腺病毒感染实验室诊断主要依靠病原学和免疫学检测证据。传统实验室检测方法有病毒分离培养、免疫学方法检测特异性抗原或检测血清中的特异性抗体等,而近年来PCR等核酸检测技术的发展使得这一技术在腺病毒快速检测和分子分型方面得以广泛应用。实验室诊断对腺病毒感染防治的意义在于,明确感染病原后:1、可以早期诊断与发现暴发疫情,及时采取防控措施;2、在治疗上减少抗生素的使用,降低耐药菌株形成的风险。


人腺病毒的遗传多样性大。目前根据免疫学和生物学特征,将人腺病毒至少分为7个种(A到G),共包括57个血清型。腺病毒不同的种或血清型有不同的组织嗜性,引起多种多样的临床症状。腺病毒的血清分型通常是用型特异性抗血清进行血凝抑制或中和试验来确定的,由于腺病毒血清型众多、特异性抗血清来源困难及价格昂贵、操作复杂等原因,使得血清分型在普通实验室难以开展。应用基于核酸序列差异的分子分型技术,如对PCR产物进行限制性酶酶切分析和序列分析等,可以将腺病毒分为不同的基因型。血清型和基因型并不完全对应;在同一个血清型内,也可以区分不同的基因型。对腺病毒进行分型,主要应用于流行病学调查。


对实验室腺病毒检测结果的解释应综合考虑患者的临床症状和流行病学资料、当地感染调查情况、采样部位及其他病原体的检测结果等。人腺病毒感染的病原学检测仍存在着一些挑战:由于某些血清型腺病毒在感染后仍能在患者无症状的情况下较长时间分泌,因此标本中检出腺病毒不一定能和疾病建立联系;从上呼吸道采集的标本也不一定能代表引起下呼吸道感染的病原;另外,呼吸道合并其他细菌或病毒感染的情况也不少见,此时确定引起感染的主要病原体是非常困难的。


一、标本采集、保存及运送

1、标本采集、保存

标本的种类包括:咽拭子、鼻拭子、结膜拭子、肛拭子、血液、尿液及粪便或组织标本等;标本采集后立即放入含3~4ml采样液的采样管中,低温保存。采样液有以下三种:pH7.4~7.6的Hank’s液、Eagle’s液或不加抗生素的生理盐水(漱口液)。为防止采样液生长细菌和真菌,在采样液中需加入抗生素及抗真菌药物。加入抗生素以后重新调节pH为7.4,配制好以后,分装每个采样管5ml,-20度冻存。

(1)咽拭子:用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧扁桃体及咽后壁,将拭子头浸入采样液中,尾部弃去。

(2)鼻拭子:将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出,以另一拭子拭另一侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中,尾部弃去(亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中,以提高分离率)。

(3)角膜拭子:用湿润的无菌棉签在角膜下部轻轻擦拭2或3次,将拭子头浸入采样液中,尾部弃去。

(4)粪便:收集患者早期腹泻粪便约10g或10ml,置无菌容器内。

(5)血标本:如做抗体测定,必须采集2份血清标本。第1份(急性期)在发病时尽早采集,第2份在发病后3~4周采集。无菌条件下抽取5ml血液,置于消毒试管。室温放置2h,待凝固后分离血清。


2、标本运送

病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量及保存运输等环节。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存,新鲜采集的临床标本应在4摄氏度下48h内运送至实验室。如未能在48h内送至实验室,应当置于-70摄氏度或以下保存,并保证采集的标本1周内送到实验室,标本应避免反复冻融。


二、检测方法

1、病毒分离与鉴定

(1)原理

病毒自身没有完整的酶系统,需依赖宿主细胞完成生长繁殖的过程,且病毒对宿主细胞具有亲细胞的特性。分离病毒就是选择合适的细胞,使标本中病毒能够生长繁殖。从标本中分离到病毒是诊断病毒感染的金标准。人类腺病毒无敏感动物,也不能在鸡胚中生长。A~E组腺病毒能在多种原代及传代细胞中培养增殖,可在连续传代的人上皮来源细胞系(HeLa、Hep-2、KB、A549)、原代人胚肾细胞(HEKC)、人胚肺成纤维细胞(HELF、W138、MRC-5)、其他胚胎成纤维细胞及原代恒河猴肾细胞上复制并产生细胞病变,被感染的细胞发生肿胀、变圆、团聚、有拉丝现象,最突出的表现是许多细胞聚在一起呈葡萄串状。而HeLa和Hep-2细胞最容易培养,是分离腺病毒的常规选择。


腺病毒F组(40型和41型)是从粪便中发现,称为肠道腺病毒。Ad40和Ad41型一直以来被认为难以在HeLa、Hep-2等细胞中常规培养,其实它们有能力在不同的细胞系中复制,如HEK293细胞。某些型别的腺病毒,由于在细胞株内生长缓慢,CPE不明显。如检测呈阴性,也可能是病毒量低,需传代3次后方可明确。这样分离鉴定病毒的全过程有时可长达2至3个月。细胞培养的优点:可同时提供大量、重复性好、生物学性状相似的实验对象用于研究;不存在特异性抗体和一些非特异性抑制因子对培养病毒的影响;细胞培养技术可与免疫学及分子生物学技术结合,易于进行病毒诊断;在大多数情况下,病毒的细胞培养能显示病毒增殖特征,如细胞病变,不需其他指示系统证实病毒是否增殖。其缺点是:操作比较复杂,需一定的条件和设备;标本的运送、保存要求高,培养时间长,耗费多;各种组织细胞娇嫩,易污染,对实验人员和实验条件的要求高。


(2)方法

下面以传代细胞Hep-2为例进行说明。

1)材料与设备

Hep-2细胞、细胞生长液、病毒生长液、Hank’s液、细胞培养液或培养板、5ml和10ml吸管、200μl和1000μl吸头、移液器、记号笔、医疗废弃物包装袋、废液缸、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱、冰柜等。


细胞生长液:500mlMEM液中加入青霉素和链霉素母液5ml(终浓度:100U/ml青霉素;100μg/ml链霉素)、HEPES缓冲液12.5ml(终浓度:25mmol/L)、胎牛血清50ml(使胎牛血清的终浓度为10%,临用时加)。


病毒生长液:500mlMEM液中加入青霉素和链霉素母液5ml(终浓度:100U/ml青霉素;100μg/ml链霉素)、HEPES缓冲液12.5ml(终浓度:25mmol/L)、胎牛血清10ml(临用时加,胎牛血清的终浓为2%)。部分型别的腺病毒(如40型及41型),胎牛血清的浓度为0.2%可较好地进行病毒分离。


2)样本处理

标本应尽早从感染部位采集,采集标本后需尽快进行病毒分离,冷链运输样本。采集患者咽喉和眼分泌物、粪便、尿液等。对咽拭子或眼拭子样本,应先将拭子在管壁反复挤压后取出;鼻腔或咽部洗液的样本,应充分振荡样本管,将黏液打碎。加抗生素(青霉素和链霉素)室温作用2h或4摄氏度处理过夜用于接毒。


3)病毒接种

选取T25细胞瓶培养细胞接毒。细胞传代后用40倍物镜观察细胞生长状态,当细胞生长至75%~90%时,成片细胞用于样本接毒。轻轻倒出细胞生长液,用10ml的无菌移液管吸取6mlHank’s液分别清洗细胞3遍。用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中,温和摇动数次,然后放于37度、5%CO2培养箱中吸附1~2h。吸出接种物,用10ml的无菌移液管吸取6mlHank‘s液分别清洗细胞2遍,然后加入6ml病毒生长液于细胞培养瓶中。置于33~35度培养箱中培养。


4)细胞培养物的收获

每日观察细胞病变情况。当75%~100%细胞出现病变时进行收获,收获之前可以将细胞放于-70度冰箱,冻融1或2次,以提高收获标本的病毒滴度。收获病毒液时,先温和摇动细胞瓶数次。收获的病毒液可以立即进行后续试验,或冻于-80度冰箱待以后试验使用。如无明显细胞病变,要盲传3代后进行鉴定。


(3)结果判定

1)观察细胞病变情况:如有腺病毒增殖,可见细胞肿胀变圆、集聚成葡萄串状,并可在感染的细胞核内形成嗜碱性包涵体,严重时细胞部分或全部脱落。

2)可用直接荧光染色法鉴定病毒:将接种病毒的细胞消化、涂片、晾干,冷丙醛固定,用荧光素标记的特异性多克隆抗体或单克隆抗体染色,如有病毒生长,在荧光显微镜下可见病毒生长部位显示荧光。

3)可用血凝试验、血凝抑制试验或中和试验检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。但因为不同型别腺病毒的敏感血细胞不同,应用受到局限。

4)使用实时PCR对收获的病毒进行定量分析和鉴定,扩增病毒hexon基因的核酸片段,测序后于GenBank中BLAST比对,分析鉴定病毒型别,此方法最为简便和常用。


(4)临床意义

在大多数情况下,病毒的细胞培养能显示病毒增殖特征,同时与免疫学及分子生物学技术结合,易于进行病毒诊断;培养获得的纯病毒可提供大量、高浓度腺病毒用于其生物特征和分子特征,为更好地防控腺病毒提供支持和依据。


2、负染色电镜检测方法

(1)原理

负染色技术是透射电镜观察颗粒性样品的常用方法。负染色剂不是增强标本本身的密度,而仅仅是增加样品的反差。负染色剂能附着在样品颗粒的周围及缝隙中,在载网上干燥后,样品颗粒为由周围染液干涸物的黑色背景中衬托出相对透明的结构。由于病毒标本较重金属离子电子密度低,电子束对重金属离子和病毒标本穿透能力不同,从而使病毒呈现明亮清晰的结构。


(2)方法

1)负染色剂:负染色剂一般是重金属的盐类水溶液。最常用的负染色剂是乙酸铀和磷钨酸纳(钾)。其他还有硅钨酸和钼酸铵等。乙酸铀渗透作用快,配制浓度为0.2%~2%,常用1%,pH4.2~4.5;染色时间为0.5~5min,常用1min。磷钨酸钾(钠),染色反差大,渗透进入标本慢;常用工作浓度为1%,pH6.4~7.0;染色时间常用1min(0.5~5min)。

2)浓缩病毒:负染色法的检测限度较高,样本中病毒颗粒密度需在106~107个/ml以上方能检出。通常可采用细胞培养得到纯腺病毒培养物进行电镜观察效果较理想。但对不能达到检测浓度的样本,需浓缩后电镜观察。常用浓缩方法有离心法、超滤法、沉淀法等。超速离心法:借助氯化铯或蔗糖作为垫层介质,采用密度梯度离心法浓缩样本并收获离心后形成的病毒条带用于制作电镜检测样本。超滤法:利用离心作用,借助超滤管去除样本内的水和盐类以及直径小于超滤管过滤孔径的物质,从而浓缩病毒。沉淀法:常用试剂是硫酸铵和聚乙二醇(PEG)。对于硫酸铵沉淀法,将饱和硫酸铵(pH7.5)逐滴加入病毒悬液至终浓度为30%~50%,缓慢摇动1~4h,再以5000~10000g离心30min,离心后的沉淀经再加入的适量缓冲液溶解后,即可制作负染样本。

3)负染色步骤:用滴管直接将5~10μl样品滴到有支持膜的载网上。可加牛血清蛋白0.1mg/ml或杆菌肽0.3mg/ml帮助扩散。几秒钟后,用滤纸吸去多余的液体,加10μl负染液至载网上,后用滤纸吸除染液,样品未干时滴染液效果好。温室干燥后,放在带盖的玻璃皿内滤纸上,电镜观察。

4)注意事项:复燃剂,如磷钨酸不能杀灭病毒,病毒仍有感染性,用过的标本、镊子、载网等应消毒;用过的铜网应用滤纸充分吸干残留标本,以免污染其他标本出现假阳性;对未知病毒应将标本稀释不同倍数,选用清晰的悬液;病理性标本常常会改变负染液的pH,要注意矫正。


(3)结果判定

在电镜下观察到球形、直径60~90nm的病毒样颗粒。


(4)临床意义

应用电镜技术不仅能确定成熟病毒粒子的大小和形态特征,还能探讨病毒在细胞内繁殖的全过程,了解病毒核酸和宿主细胞核骨架的关系等。


3、免疫学方法检测腺病毒感染

检测腺病毒感染的免疫学检测方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附法(ELISA)、金标法及中和实验等,目前最为常用的是免疫荧光法和ELISA。免疫荧光法主要用来测定样本中的腺病毒抗原,ELISA主要用来测定样本中的抗原及IgA、IgM或IgG抗体。


免疫学检测方法可进行快速诊断,但一般不能进行腺病毒分型。腺病毒型别众多,经典的型别鉴定方法以血清中和试验为主,但很少有实验室具备针对腺病毒各种型别的标准血清,且血清学实验操作较为繁琐,部分血清型之间还存在交叉反应,因而在实际工作中较难开展。


(1)免疫荧光法检测腺病毒抗原

免疫荧光法诊断呼吸道腺病毒感染速度快、实用性强已被许多研究证实。其优点是方法简便、迅速,通常1~2h即可完成;缺点是敏感性偏低;每检查一种抗原就需要制备一种单克隆荧光抗体;在筛查中有4%~8%的标本为非特异性染色,阅片人的经验对于区别特异与非特异染色是非常重要的。


1)原理

免疫荧光技术是在免疫荧光电镜下观察荧光素标记的单克隆抗体与标本中的抗原结合情况。腺病毒免疫荧光检测试剂通常以异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体直接与腺病毒六邻体抗原相结合,可用于培养细胞、丙酮固定的涂片染色,也可直接对结膜和角膜拭子进行染色,用荧光显微镜观察。


2)方法

标本收集、运送和储存:因鼻咽上皮含有大量的上皮细胞,所有的鼻咽抽吸物和洗涤分泌物是最佳的直接检测标本。标本须在冰上运送到实验室,尽可能快速地进行检测。避免对样本进行冻融,因为这样一来会使一些病毒丧失活性,导致检测灵敏性降低。


固定样本:将标本在漩涡混匀器上轻微混匀,2000r/min离心10min,弃去上清液;留约100~150μl上清液,吸管上下吹打混匀,形成混浊细胞悬浮液;在玻璃片上点样,每个点加15μl细胞悬液。电吹风冷风下风干10~15min至干燥;浸没在冷丙酮溶液中固定10min;取出玻片,风干。


染色:在标本片和对照玻片的每个细胞点加上20μl含伊文斯蓝的荧光素标记腺病毒单克隆抗体,37度孵育15~30min,PBS洗片3次,每个细胞点加上1滴封闭液。最后覆上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果。


免疫荧光法检测人腺病毒试剂盒的使用:直接免疫荧光法检测腺病毒多以试剂盒的形式应用,筛查试剂中含有6种混合单克隆抗体,即甲型及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒1、2、3型及腺病毒单克隆抗体。可以同时在一孔细胞涂片上进行7种病毒抗原筛查。当筛查试验阳性时,再用单一特异性单克隆抗体对新鲜标本孔进行检测,或直接使用单一特异性单克隆抗体对新鲜标本孔进行检测。现在常用的腺病毒直接免疫荧光试剂为Chemicon呼吸道病毒诊断试剂及呼吸道病毒抗原筛查试剂,其中Chemicon呼吸道病毒诊断试剂的腺病毒检测范围包括Adl、3、5、6、7、10、13、14、18、31、40和41型等12个亚型,这些亚型基本囊括了人腺病毒常见的致病型。


3)结果判定

荧光标记的腺病毒特异性单克隆抗体与细胞中相应的病毒抗原结合后,形成抗原抗体复合物,荧光显微镜下细胞内显示苹果绿色荧光;而未发生抗原抗体特异性反应的细胞,被Evans蓝染成红色。显示苹果绿荧光的细胞,为阳性细胞。当放大倍数为200倍时,在视野中找到≥3个阳性细胞,判为标本阳性。腺病毒在细胞中的感染特征为胞浆颗粒型,细胞核均质性。


4)临床意义

腺病毒直接免疫荧光法常用来检测临床样本中的腺病毒抗原,以分析腺病毒的感染情况,但很少用于腺病毒分型鉴定。


(2)ELISA法检测腺病毒IgA、IgM或IgG抗体

由于腺病毒相关血清型之间存在着交叉反应,而且可能与其他相关病原存在交叉反应,因此有时ELISA法检测腺病毒抗体实验可能会出现假阳性的结果。但ELISA敏感性高,且方便、简易、可靠,易于操作,3~4h即可得出结果,适合制成试剂盒普遍应用于临床。


可通过检测发病5~15d急性期血中腺病毒特异性IgA或IgM,或急性期、恢复期双份血中IgG抗体水平升高来诊断腺病毒感染。常采用ELISA间接法检测腺病毒IgA、IgM或IgG抗体。不同的病程中所取标本检测阳性率存在差异。


1)原理

将抗原物理性地包被吸附在固相载体上,加患者血清到板孔中,其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合,形成免疫复合物。洗板除去多余物质,加入酶标记的抗IgA、IgM或IgG抗体,通过共价键生成抗原-待测抗体-酶标记抗体复合物,此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;加入底物(对硝基苯磷酸盐)反应生成有色产物,颜色反应的强度与标本中相应抗体的量呈正比例。


2)方法

材料:试剂盒、水浴箱、移液器、酶标仪、双蒸水或去离子水、吸水纸、取样吸头和计时器。条放在微孔板框上并准备好原始记录单;分别加入已稀释样本或对照血清100μl/孔,留一孔作底物空白对照。将样本于37度湿盒内孵育60min;缓冲洗液洗涤板孔4次(使用自动洗板机或手工洗板);加入IgA/IgM/IgG酶标记抗体100μl/孔(空白孔除外),37度湿盒内孵育30min;洗涤板孔后,加入底物溶液100μl/孔(包括空白孔),37度湿盒内孵育30min;加终止液100μ/孔。60min内,用酶标仪在450nm波长处以空白孔调零,逐孔测定吸光度(A)值。


3)结果判定

底物空白的A值须<0.25,试剂盒中阴性、阳性对照、空白对照须成立。质控血清检测结果成立。标准血清的平均A值必须在有效范围内,此范围已在试剂盒专用的《质量控制证书》中给定(减去底物空白之后)。


取阳性对照平均OD值后,阳性对照OD值平均值乘以《质量控制书》上给出的上、下限系数,即可得到阳性指标和阴性OD值判定范围。小于阴性指标OD值为阴性,大于阳性指标OD值为阳性。在大于阴性指标OD值、小于阳性指标OD值范围区间内,为临界值。


(3)中和实验

中和实验可以在患者血清中检出抗体,并可以鉴定病毒型别,以往是病毒分型的标准。但是中和实验操作繁琐、耗时费料,而且腺病毒有些型之间存在交叉反应,引起中和实验的不精确,故现在临床上几乎不用。但其作为经典方法在病毒鉴定中起着重要的作用,许多新的检测方法都要以之为标准来进行比较。


1)原理

中和实验是病毒血清学实验中常用的一种抗原-抗体反应,用以测定人或动物血清中和抗体抑制病毒感染的生物效应,是反映机体抗特定病毒感染能力最可靠的方法。中和抗体是指能与病毒结合,使之失去感染力的抗体,主要是IgG。特异性的抗病毒免疫血清(中和抗体)与病毒作用,能够破坏病毒表面的受体作用点,抑制病毒对敏感宿主的吸附、穿入和脱壳,从而阻止病毒的繁殖,使病毒失去感染能力。


2)方法

细胞培养中和实验法一般多采用稀释血清、固定病毒量的方法,以抑制50%病毒发生反应的血清最高稀释度作为中和抗体效价。用Hela或Hep-2细胞按常规方法传代培养。测定其半数组织培养感染剂量(TCID50)。


病毒TCID50滴定:实验前需要进行病毒的测定,选出病毒接种的浓度,通常用使半数细胞孔有病变的病毒稀释度倒数的对数来表示。测定步骤如下:取病毒阳性细胞管冻融3次,2000r/min离心10min,吸取上清,加Eagle’s液10倍系列稀释为10-1~10-8病毒液,以每孔25μl加入细胞板内,每稀释度做4个重复。每孔加细胞悬液25μl,同时设细胞对照(25μl稀释液+25μl细胞悬液),37度培养7天,观察细胞病变。计算病毒株的TCID50。


中和实验:受检血清经56度、30min灭活处理后,用培养液做4倍稀释,将各稀释血清与等量的100倍TCLD50病毒混合,37度水浴1~3h,每份标本感染2个细胞孔,37度静置培养,同时设病毒正常细胞对照。根据细胞病变结果,判定中和效价。


3)结果判定

以病毒对照管呈现++++病变时判断结果,以完全抑制细胞病变为终点。若细胞出现病变,表示病毒没有被中和;反之,如不出现病变,表示病毒被抗体中和。以能保护50%或50%以上细胞孔不出现病变的血清稀释度为中和抗体效价。


4)临床意义

此方法可用于对腺病毒进行型别鉴定,也可用于测定患者血清中的中和抗体水平,评估机体抗特定型别腺病毒感染的能力。


4、核酸检测及基因分型技术

(1)聚合酶链反应(PCR)

核酸检测是一种鉴定腺病毒快速而有效的方法,即使基因组含量很低或灭活病毒也可以检测到。目前对腺病毒的核酸检测主要采用PCR方法。腺病毒为双链DNA无包膜病毒,常规方法是提取标本中病毒DNA作为模板,采用普通PCR或实时PCR等检测病毒核酸。有关腺病毒PCR检测的方法国内外已有很多报道,如《中华人民共和国卫生行业标准》(WS271-2007)感染性腹泻诊断标准中采用与Ad40及Ad41六邻体基因高度保守区互补引物扩增腺病毒DNA。引物hexAA1885的序列为:5’-GCC GCA GTG GTC TTA CAT GCC ACA CTC-3’;引物hexAA1913的序列为:5’-CAG CAC GCC GCG GAT GTC AAA-3’。PCR产物为301bp,PCR反应条件:94度3min;94度40s。55度40s,72度40s,35个循环;72度延伸10min。


实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR荧光定量反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。与普通PCR相比,实时荧光定量PCR具有更简便、更灵敏、更快速等优点,已广泛应用于病原微生物的检测,在腺病毒检测中也得到应用。


核苷酸序列测定:人类腺病毒血清型众多,分为7个组(A~G),遗传变异较大。常规PCR或实时PCR测定型别报道较少。通常是扩增病毒六邻体基因后测序,确定型别。可参考Sarantis方法合成引物,上游引物为5’-CTG ATG TAC TAC AAC AGC ACT GGC AAC ATG GG-3’,下游引物为5’-GCG TTG CGG TGG TGG TTA AAT GGG TTT ACG TTG TCC AT-3’。扩增hexon基因的超变量区的核酸片段,测序后于GenBank中BLSAST比对,分析其血清型及变异状况。


(2)核酸分子杂交

核酸分子杂交技术是在1968年由华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明的,所依据的原理是:具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。有关腺病毒核酸分子杂交技术在20世纪70年代已有报道,以一段与腺病毒DNA互补的核苷酸序列单链作为基因探针,以放射性或非放射性标记物进行标记,可采用Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交(三明治杂交)、斑点杂交及原位杂交等方法进行核酸分子杂交。


Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法,基本操作过程如下:腺病毒基因组DNA用限制性内切酶酶切后用琼脂糖凝胶电泳,碱变性,将酶解片段转移至硝酸纤维素膜上,加入杂交液和标记探针进行固相杂交,然后洗涤膜,去除多余探针,最后于X射线片上放射自显影,根据基因探针与待测DNA限制酶酶切片段杂交的带谱,可以直接确定病毒的存在的状态,同时可分析是否与宿主基因发生整合。


斑点印迹杂交和狭线印迹杂交是在Southern印迹杂交基础上发展出来的快速检测特定核酸分子的杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置,使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上,并有规律地排列成点阵或线阵,一次可做大批量样品的筛选,同时还可半定量反映样品中的病毒含量,这两种方法在腺病毒检测中均有报道。


三明治夹心杂交是Dunn在1977年首次介绍的,由Ranki在1983年进一步改善完成,是一种主要应用于微生物检测的分子生物学方法。三明治夹心杂交用两个探针,即捕获探针和信号探针,两个探针分别用不同的标记物标记(如生物素、地高辛等)。检测时,首先将捕获探针固定于载体上,然后加入待检测样品的核酸提取物或者细胞裂解液;洗去未杂交的样品核酸,再加入信号探针,最后显色检验。用于标记的物质包括荧光分子、特殊酶类和放射性元素等。其中捕获探针的载体可以是塑料分析板,可以是96微孔板,也可以是磁珠,在1983年就有应用其方法对腺病毒进行检测的报道。


(3)基因芯片

基因芯片又称DNA芯片,属于生物芯片的一种,是分子生物学与微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术、信息科学技术和计算机技术等学科交叉融合而成的一项新技术,是伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的前沿生物技术。其工作原理是:经过标记的待测样本DNA通过与芯片上特定位置的探针杂交,可根据碱基互补配对的原则确定靶DNA序列,经激光共聚焦显微镜扫描,以计算机系统对荧光信号进行比较和检测,迅速得出所需的信息。基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍,可在一次试验中分析成千上万个基因,是一种进行DNA序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。基因芯片在人类病毒性疾病的诊断和研究中的意义非常巨大。有关腺病毒的基因芯片的检测技术已有应用的报道,由于基因芯片具有高通量的优点,所以一次可检测所有已知的基因型别。另外,也可以以一张基因芯片同时检测腺病毒及其他病毒和细菌。基因芯片还可用于分析腺病毒中一些目标基因的表达水平,通过对不同基因mRNA的检测,根据基因芯片上荧光的强弱来研究基因表达的强弱。


由于基因芯片技术目前尚不够完善,还在不断发展之中,特别是其价格昂贵,对操作的要求较高,使其应用范围受到很大的限制。相信在不远的将来,随着现代分子生物学的迅速发展,基因芯片必将在腺病毒检测中发挥越来越大的作用。


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